2022年发表于《Nature Communications》（IF =17）

一、研究背景
DAXX和ATRX被认为是限制端粒选择性延长(ALT)的肿瘤抑制蛋白。基因组测序研究发现，ATRX、DAXX和组蛋白H3.3的功能缺失突变与ALT诱导的胶质瘤、肉瘤和胰腺神经内分泌肿瘤等密切相关。DAXX和ATRX能够将组蛋白H3.3组装到染色质中，并且能够抑制ALT。ALT细胞端粒异染色质更容易接近，并会在端粒积累高水平的DNA损伤。TP53 (p53)突变，会加剧DNA损伤的程度和耐受性。p53是一种DNA结合蛋白，调控细胞衰老和凋亡相关基因的转录。在ALT中，DAXX-ATRX与p53 DNA损伤应答功能之间的相互作用机制尚不完全清楚。在ALT癌症中存在ATRX、DAXX、H3.3、p53的多发突变，表明这些途径可能影响癌细胞进展。之前的一项研究证明ATRX或DAXX的缺失并不足以导致ALT的出现。本研究利用CRISPR/Cas9敲除DAXX或ATRX的同源胶质母细胞瘤细胞系，研究DAXX和ATRX功能丧失与p53 DNA损伤修复途径之间的关系。研究结果表明，DAXX-ATRX调节p53染色质可及性和DNA损伤反应，H3.3可能也参与了这一过程，而这一通路的破坏对ALT细胞的存活至关重要。

二、研究结果
1、在具有ALT样特征的DAXX和ATRX敲除细胞中p53通路的解除
之前报道ATRX和DAXX缺陷的U87-T胶质母细胞瘤细胞系获得了ALT样特征。在该研究中，发现DAXX或ATRX的短暂缺失导致衰老细胞的增加，对ALT样DAXX_KO和ATRX_KO细胞进行了RNA-seq转录组分析，以了解其共同特征。相对于亲本U87-T对照细胞，DAXX_KO和ATRX_KO显著影响了2724个基因(FDR < 5%)(图1a)。重叠的基因富p53在KO细胞系中达到了最显著(图1b)。在28个最高上调基因(DAXX_KO和ATRX_KO)中，确定了7个已知的p53直接靶点，包括TMTC1、PTGES、CSF1、PLAGL1、MRAS、RTN1和CD70(图1c)。其中一些基因与胶质母细胞瘤的发生有关。

图1 DAXX_KO和ATRX_KO U87细胞的转录组学分析

2、缺乏ATRX或DAXX的ALT样细胞的DNA损伤反应减弱
通过比较亲本对照U87-T细胞系、ATRX_KO和DAXX_KO细胞对DNA损伤的反应能力，发现拓扑异构酶抑制剂依托泊苷在亲代U87-T细胞中诱导了有效的p53反应和相应的生长抑制(图2)。依托泊苷减弱了KO细胞系的p53反应，并积累了更高水平的γ- H2AX DNA损伤。正常生长条件下，DAXX_KO和ATRX_KO细胞相对于对照组在S/G2期的比例减少；而在依托泊苷处理后，KO细胞处于S期的比例相对于对照组增加。综上发现表明，DAXX和ATRX KO U87-T细胞在DNA损伤反应中，细胞周期分布会发生变化，细胞周期会发生阻滞。


图2 DAXX_KO和ATRX_KO U87细胞的异常DNA损伤反应

3、DAXX_KO和ATRX_KO的U87 ALT样细胞中p53应答引起的转录组变化
与亲代对照U87-T细胞相比，DAXX_KO和ATRX_KO ALT样细胞对DNA损伤剂依托泊苷的转录组变化(图3a)。添加依托泊苷后，DAXX_KO有933个基因、ATRX_KO有1562个基因上调程度显著低于亲代对照U87-T细胞的上调程度。DAXX_KO和ATRX_KO有502个基因重叠，表明两种KO细胞系之间的功能作用非常相似。富集分析显示，DAXX_KO或ATRX_KO细胞中受影响最严重的几种调节因子，包括p53，在添加依托泊苷时被显著抑制(图3b)。RT-qPCR显示，一些p53应答基因如GADD45A、CYP4F3和PARDG6受到DAXX_KO和ATRX_KO的影响，而其他基因如CDKN1A，在DAXX_KO中没有明显的影响(图3d)。同时RNA-seq分析未检测到p53发生突变，表明p53应答降低不是由于p53突变造成的。

图3 DAXX_KO和ATRX_KO U87细胞DNA损伤反应的转录组学分析

4、DAXX_KO和ATRX_KO U87 ALT样细胞中p53染色质结合的改变
由于DAXX_KO和ATRX_KO细胞中许多p53应答基因都受到了影响，通过ChIP-seq检测了依托泊苷处理的DAXX_KO细胞和对照细胞中p53的结合情况(图4)。图4a展示了p53 ChIP-seq峰在整个基因组中的分布。与DAXX_WT相比，绝大多数p53 ChIP-seq号峰在DAXX_KO中下调(图4b，c，d)。下调的基因包括LIF、LMNA和WDR43，而上调的基因包括EDF1、METTL7B和ARHGAP6。图4e展示了DAXX_KO细胞中p53结合位点在CDKN1A和GADD45A处减少。ChIP-qPCR验证了依托泊苷处理时DAXX_KO和对照细胞中p53结合的一些变化(图4g)。相较于亲代U87-T细胞，依托泊苷处理的DAXX_KO细胞中p53与p21启动子(CDKN1A)、GADD45A以及18q和13q亚端粒位点结合的诱导作用减弱。图4h的ChIP- qPCR分析显示，在ATRX_KO细胞中，与U87-T对照细胞相比，依托波苷处理后p53与靶基因的结合减少(图4h)。

图4 DAXX_KO和ATRX_KO U87细胞中p53染色质结合的减少

5、DAXX和ATRX依赖于染色质可及性调节p53结合模式
为了确定ATRX和DAXX是否通过染色质可及性调节p53结合，本研究对依托泊苷或DMSO对照处理的WT、DAXX_KO和ATRX_KO细胞进行了ATAC-seq检测(图5)。p53结合的减少与ATAC-seq峰的缺失之间存在很强的相关性(图5a、b)。与p53 ChIP-seq峰直接重叠的ATAC-seq峰，在DAXX_KO和ATRX_KO中相同的峰其强度有降低趋势(图5c)。在PIEZO2基因位点上，经过或未经过依托泊苷处理的对照细胞中，p53结合位点与ATAC-seq峰重叠，而在DAXX_KO和ATRX_KO中，这些峰都减少了(图5d)。


图5 p53结合与染色质可及性变化相关

6、DAXX挽救p53结合需要ATRX的相互作用
为了证明p53结合缺失是DAXX_KO的特异性表型，而不是CRISPR基因编辑的脱靶效应，使用了表达全长野生型YFP标记的hDAXX 的DAXX KO细胞系(图6a)。结果可以看到DAXX过表达导致依托泊苷治疗后p53蛋白水平升高。这表明p53蛋白表达水平可能部分依赖于DAXX。 ChIP-qPCR研究表明，在DAXX_KO细胞中，p53与各种p53应答元件的结合存在缺陷，但在表达hDAXX的细胞中得到了恢复(图6b)。这在p21启动子、GADD45A基因和亚端粒18q和13q上得到了证实。与野生型hDAXX相比，L130R突变体不能挽救p53与所有p53应答元件的结合(图6d)，说明需要ATRX的相互作用。

图6 DAXX_KO U87-T细胞中p53功能依赖于DAXX

7、DAXX和ATRX的缺失改变了p53结合位点的组蛋白组成
为了检验DAXX_KO和ATRX_KO是否改变了p53结合位点的组蛋白组成，首先用ChIP-qPCR检测了H3.3的结合。发现几个p53结合位点的组蛋白H3.3缺失，包括亚端粒13q和18q(图7a)。
点印迹分析结果发现DAXX_KO细胞在端粒重复序列上的H3.3含量有所降低(图7b)，发现ATRX_KO和DAXX_KO细胞中所有测试位点的总H3也减少。依托泊苷处理导致对照细胞中总H3减少，但在ATRX_KO或DAXX_KO细胞中没有减少(图7c)。在ATRX_KO和DAXX_KO的所有测试位点，相对于亲本对照细胞γ - H2AX升高，依托泊苷处理后的增加的倍数减少了(图7d)。这些发现表明DAXX_KO和ATRX_KO ATL样细胞改变了组蛋白组成，组蛋白总H3和H3.3减少，在一些p53结合受损基因组位点γH2AX升高。

图7 DAXX _KO和ATRX_KO ALT样细胞中p53结合位点组蛋白组成改变

三、研究结论
DAXX或ATRX的缺失会导致p53结合位点染色质可及性的缺失，并且会改变p53结合位点的组蛋白组成，从而减弱p53的应答，从而影响癌症细胞的进展。

参考文献：
DAXX-ATRX regulation of p53 chromatin binding and DNA damage response.[J]Nature Communications, 2022.