2022年发表于《Clinical and Translational Medicine》（IF =10.4）

研究框架：


一、研究背景
进行性核上性麻痹(PSP)是一种神经退行性疾病，临床表现为进行性帕金森病、体位不稳、垂直扫视减慢、核上凝视性麻痹和认知能力下降。该疾病是由大脑特定区域的细胞逐渐退化引起的，包括苍白球(GP)、黑质、丘脑底核和额叶；但PSP发病机制尚不清楚。在PSP中研究最多的基因是微管相关蛋白tau (MAPT)，它在人脑中通过选择性剪接表达和调节。富亮氨酸重复激酶2 (LRRK2)的突变，被认为是帕金森病(PD)最常见的遗传原因之一，也被认为是PSP的原因。DCTN1参与细胞分裂和运输等细胞功能，在PSP临床患者中可发现其突变。
目前，还没有针对PSP的疾病改善治疗方法。利用帕金森病和阿尔茨海默病的药物来控制PSP症状的效果有限。因此，对PSP患者进行基于质谱的人脑蛋白质组学分析对于了解该疾病的发病机制至关重要。在本研究中，对15名PSP患者、15名PD患者和15名健康对照(HC)进行了基于质谱的GP蛋白质组分析，发现了相关蛋白和信号通路，为研究PSP的发病机制提供了基础。

二、研究结果
1、GP样品的定量蛋白质组分析
本研究对15名PSP患者、15名PD患者和15名HC患者的45份GP样本进行了TMT标记定量蛋白质组分析。每个TMT实验批次都会设置QC，以评估技术变化和信噪比，如图1所示。从单一批次和所有五个批次中鉴定出的常见蛋白质数量分别是8500和6900(图2A)。为了比较不同批次的蛋白质丰度，强度值进行归一化。超过70%的蛋白质CV值<30%，约90%的蛋白质S/N值> 1 (图2C)，表明质谱分析结果可靠。

图1 PSP患者、PD患者和HC个体GP样本蛋白质组学研究的实验策略

图2 五批11 plex TMT实验的蛋白质组学数据质量评价

2、蛋白质组数据的统计分析
为了鉴定PSP患者GP中与PD或HC个体相比有差异表达的蛋白质，使用两种不同的分析：基于SAM和基于bootstrapROC的分析。
在基于SAM的方法中，PSP与HC、PSP与PD、PD与HC的差异表达蛋白数量分别为325、934和18个；分别分析了各组中，上调和下调幅度最大的蛋白(图3A)。基于bootstrap ROC的方法中，PSP与HC、PSP与PD、PD与HC的差异表达蛋白数量分别为463、1066和55(图4B)。分别分析了各组中，上调和下调幅度最大的蛋白(图3B)。PSP与HC、PSP与PD、PD与HC中重叠的蛋白分别有225、809和15个(图3C)。

图3 从PSP，PD和HC中鉴定的差异GP蛋白的火山图和ROC图

3、基因集富集分析
为了揭示PSP GP中异常的信号通路，进行了KEGG通路基因集富集分析。当PSP与HC比较时，PD途径是最富集的途径，其次是氧化磷酸化，阿尔茨海默病，亨廷顿病，非酒精性脂肪。PD途径富集了25种蛋白质，多数蛋白质是与线粒体功能相关的蛋白质，如电子传递(COX4I1、COX5A、COX6B1、COX7A2、CYCS和NDUFA4)等(图4A)。富集于其他四条通路的蛋白质也与线粒体功能相关。与HC相比，PSP中所有线粒体相关蛋白均下调。
PSP与PD相比较前5条富集最多的通路，与PSP与HC比较时富集最多的通路相同，但每条通路中富集的蛋白数量增加了一倍以上。在PSP与HC的比较中，PD通路中富集了60个蛋白，其中大多数蛋白与线粒体功能相关(图4B)；这些线粒体蛋白包括ATP合成酶(ATP5F1、ATP5H、ATP5J和ATP50)和酰基载体蛋白(NDUFAB1)，以及在PSP和HC的比较中已经观察到的细胞色素c相关蛋白，NADH脱氢酶，琥珀酸脱氢酶，ADP / ATP转位酶，细胞色素b-c1复合物蛋白。在PSP与HC的比较中，在其他四种途径中富集的大多数蛋白质也与线粒体功能有关。与HC相比，PSP中所有线粒体相关蛋白均下调。
基因集富集分析结果表明，线粒体蛋白的下调可能与PSP发病机制有关。


图4 通过基因集富集分析确定帕金森病通路图

4、蛋白质-蛋白质互作分析
基因集富集分析显示，前5条通路中富集的蛋白大部分与线粒体功能有关。本研究使用STRING PPI分析方法对差异表达蛋白进行了PPI分析。
对于PSP和HC比较中的差异表达蛋白，STRING PPI分析产生了两个高度连接的簇和一个中等连接的簇(图5A)。连接最紧密的簇由线粒体核糖体蛋白(MRPs)形成。第二和第三大连接簇是由NADH脱氢酶和细胞色素b-c1复合物蛋白形成的。对于PSP和PD比较中的差异表达蛋白，STRING PPI分析产生了一个高度连接和三个中等连接的簇(图5B)。所有连接的簇都是由与线粒体功能相关的蛋白质形成的。Reactome分析还显示，前三种富集途径均与线粒体呼吸电子传递有关。相互作用组分析结果还表明，与HC和PD相比，线粒体蛋白是PSP差异表达蛋白的主要成分。

图5 STRING PPI分析了PSP与HC和PSP与PD之间差异表达蛋白的网络连通性

5、蛋白共表达网络分析
PSP患者GP中差异表达蛋白的基因富集和PPI分析表明，主要是线粒体蛋白的异常。为了排除PSP病理以外的因素对线粒体蛋白差异表达的影响，本研究进行了WGCNA，其中鉴定了具有相似共表达模式的蛋白质，生成了由具有相似表达模式的蛋白质组成的多个模块。由于PD、线粒体翻译和核糖体途径是基因集富集和PPI分析中最富集的途径，因此研究了富含属于这三种途径的蛋白质的模块是否与疾病诊断以外的变量相关。
WGCNA结果表明，来自PSP和HC的M12和M11模块以及来自PSP和PD的M6模块富集了线粒体相关蛋白。除了诊断组之外，没有一个模块显示出与其他变量的高度相关性。这表明本研究中的线粒体相关蛋白与PSP发病机制高度相关，其发病机制仍有待进一步研究。


图6 GP蛋白质组数据的WGCNA分析，用以探讨模块-性状关系

6、线粒体电子传递链中差异表达蛋白的验证
本研究的生物信息学分析表明，线粒体电子传递链蛋白是PSP GP中差异调节的关键分子，因此对由4名PSP、4名PD和4名HC个体组成的独立队列进行了Western blot实验，验证GP中线粒体电子传递链蛋白。选择了电子传递链中的5个蛋白(SDHC、SLC25A5、NDUFB11、UQCRH和NDUFA4)进行验证，但Western blot仅检测到3个蛋白(NDUFB11、UQCRH和NDUFA4)。只有NDUFA4在PSP下降，且有统计学意义。这些结果可能是由于蛋白质组学和Western blot实验之间的样品制备差异造成的；并且我们知道这种基于光谱的蛋白定量数据通常示与基于Western blot的定量相关性较差。


图7 富含帕金森病、线粒体翻译和核糖体途径的WGCNA模块的网络连接性

三、研究结论
本研究通过对15名PSP患者、15名帕金森病(PD)患者和15名健康对照(HC)患者的GP样本进行TMT标记定量蛋白质组分析，鉴定出超过10000种蛋白质。结果显示帕金森病、氧化磷酸化和阿尔茨海默病途径是最富集的途径，线粒体电子传递链蛋白是进行性核上性麻痹患者苍白球下调的关键分子，线粒体呼吸电子传递链复合体可能参与PSP的发病机制。

参考文献：
Mass spectrometry-based proteomics analysis of human globus pallidus from progressive supranuclear palsy patients discovers multiple disease pathways.[J]Clinical and Translational Medicine, 2022.

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