2020年发表于《Molecular Therapy-Nucleic Acids》（IF =9.04）

一、研究背景
胆管癌（CHOL）是一种发生于胆道上皮的肿瘤，以胆管细胞分化为特征。CHOL通常按解剖位置分为肝内、门周和远端，占原发性肝胆恶性肿瘤的15%-20%。大多数患者在发病时已处于疾病晚期且预后不佳；手术切除是早期疾病患者的首选治疗选择，晚期的全身治疗效果有限。因此，迫切需要增加对其分子肿瘤生物学的认识。
NGS测序技术使我们能够分析许多癌症基因组图谱。microRNA (miRNA, miR)可以与长链非编码RNA (lncRNAs)、环状RNA (circRNAs)等相互作用，形成复杂的miRNA介导的竞争性内源RNA（ceRNA）网络。ceRNA串扰会破坏细胞过程和功能的平衡，导致癌症等疾病的进展。最近有研究报道，lncRNAs H19和HULC在氧化应激刺激下，分别通过“海绵化”let-7a/let-7b和miR-372/miR-373，通过增加炎症过程中IL-6和CXCR4的表达，调控细胞在CHOL中的迁移和侵袭。然而，很少有研究利用全转录组测序策略来描绘CHOL的转录组图谱。
本研究中，基于8例CHOL患者的癌症组织(C)及其癌旁组织(CP)进行了全转录组测序。随后，对C组和CP组进行差异mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA表达分析，并进行功能和相互作用预测分析。此外，使用TCGA数据库中的CHOL数据验证结果。该研究可能为CHOL发生和发展的分子基础提供新的见解，并为不同的预后和治疗提供潜在的生物标志物。

二、研究结果
1、差异表达分析
根据筛选标准，共鉴定出2895个差异表达mRNA (dif-mRNA)，其中上调2290个，下调605个；鉴定出56个dif-miRNA，其中30个；鉴定出110个dif- circRNA，其中30个表达上调，80个表达下调。Dif-mRNA、dif-miRNA、dif-lncRNA、dif-circRNA的双向聚类热图中肿瘤样本与对照样本明显分离（如图1），说明结果是可靠的。

图1 差异表达分子热图

2、dif- mRNA的功能富集分析
对dif- mRNA进行功能富集分析，图2的GO-BP和KEGG通路分析显示：上调的基因主要涉及mRNA剪接，rRNA加工，剪接体RNA运输；下调基因主要涉及氧化还原过程，血小板脱颗粒代谢途径和补体和凝血级联。

图2 GO-BP和KEGG通路分析

3、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络及模块提取
基于dif-mRNA的PPI网络包括421个节点和934个相互作用对，拓扑得分高的节点可视为网络的关键节点。使用Cytoscape插件MCODE从PPI网络中聚合并提取了四个子网络模块，其中的基因均上调(图3A)。ModuleA (score = 20.5)包含21个节点和205个相互作用对，其中核糖体蛋白包含最多，如核糖体蛋白L23a (RPL23A，degree= 24)。ModuleB (score = 12.462)包含14个节点和81对相互作用。ModuleC (score = 12)包含12个节点和66对互作对。ModuleD (score = 12)包含13个节点和7对相互作用。
此外，对模块中的基因进行GO-BP富集分析(图3B)。模块A中的基因显著富集于：靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白，病毒转录，核转录mRNA分解代谢过程，无义介导的衰变。模块B中的基因显著富集于：mRNA剪接，剪接体小核糖蛋白颗粒(snRNP)组装。模块C中基因显著富集于：细胞氨基酸代谢过程的调控，NF-kB信号。模块D中的基因显著富集于：rRNA处理，小亚单位rRNA (SSU-rRNA)的成熟。

图3 蛋白相互作用（PPI）网络中四个模块的提取及GO-BP富集分析

4、miRNA、lncRNA和circRNA相关靶基因富集分析
根据参与dif-miRNA-dif-mRNA、dif-lncRNA-dif-mRNA和dif-circRNA-difmRNA共表达关系的mRNA，进行KEGG富集分析，结果用气泡图表示(图4)。结果显示，与miRNA、lncRNA和circRNA相关的基因在内吞作用和剪接体中均显著富集。

图4 KEGG通路富集的气泡图

5、ceRNA网络构建
基于lncRNA-mRNA共表达关系以及dif-miRNA-dif-mRNA和dif-miRNAdif-lncRNA的调控关系，筛选出受同一miRNA调控的显著差异表达的lncRNA和mRNA。最终共获得91个lncRNA-miRNA-mRNA相互作用(图5)，其中lncRNA上调7个，mRNA上调71个，mRNA下调12个，miRNA上调1个，miRNA下调1个。

图5 lncRNA-miRNA-mRNA网络

基于circRNA-mRNA共表达关系以及dif-miRNA-dif-mRNA和dif-miRNAdif-circRNA的调控关系，筛选受相同miRNA调控dif-circRNA和mRNA，最终得到circRNA-miRNA-mRNA的494种相互作用关系。其中circRNA上调22个，下调42个；mRNA上调204个，下调95个；miRNA上调6个，下调5个。circRNA-miRNA-mRNA网络如图6所示。
图6 circRNA-miRNA-mRNA网络

进一步根据lncRNA-miRNA-mRNA和circRNAmiRNA-mRNA网络，进一步筛选受同一miRNA调控的差异表达的circRNA、lncRNA和mRNA。最终共获得158对相互作用对(图7)，其中circRNA上调7个，下调13个；lncRNA上调7个；mRNA上调90个，下调40个；miRNA上调1个，下调1个。

图7 竞争性内源性RNA (ceRNA)网络

6、TCGA CHOL数据验证
TCGA CHOL mRNA和miRNA数据的筛选阈值设置为p < 0.01，共获得9,446个dif-mRNA和178个dif-miRNA，与本研究分析得到的dif-mRNA和dif-miRNA进行比较。维恩图如补充图1所示，在TCGA数据中发现了2,444/ 2,895(84.42%)dif-miRNAs的差异表达，在TCGA数据中也发现了18/56(32.14%)dif-miRNAs的差异表达。该差异结果可能与样本差异或不同阈值选择有一定关系。其中，在18个共有的dif- miRNA中包含hsa-miR-144-3p。富集程度较高的基因也包含在2444个共有的dif- mRNA中，包括RPS11、RPL8、SNRPD2、SNRPE、SNRPD1、PSMD3、PSMD13、MPHOSPH10和UTP6。

补充图1 dif- mrna和dif-miRNAs的VENN图

三、研究结论
本研究基于8例CHOL患者的肿瘤组织(C)及其癌旁组织(CP)进行了全转录组测序，进行差异表达分析和功能相互作用预测分析，以研究胆管癌(CHOL)中的基因调控网络。此外，使用TCGA数据库中的数据集对CHOL数据进行验证。大多数DEGs和少数miRNA(如hsa-miR-144-3p)通过TCGA数据成功验证。参与RNA剪接和蛋白质降解过程的基因以及miR-144-3p可能在CHOL的发病机制中起重要作用。该研究可能为CHOL发生和发展的分子基础提供新的见解，并为不同的预后和治疗提供潜在的生物标志物。

参考文献：
Whole-Transcriptome Sequencing Identifies Key Differentially Expressed mRNAs, miRNAs, lncRNAs, and circRNAs Associated with CHOL.[J]Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2020.

.........................................................................................................................................................................................................