2021年发表于《Science of the Total Environment》（IF = 10.2）
镍(Ni)及其化合物是众所周知的环境污染物，对健康的不良影响包括致癌、多器官毒性和皮炎，危害程度取决于镍的暴露途径和水平。人体接触镍的主要途径有呼吸道吸入、口服和皮肤接触。慢性口服Ni暴露对神经系统的影响及其潜在作用机制还不清楚。
组蛋白低乙酰化是一种公认的表观遗传修饰，已在镍暴露的不同细胞中被发现。虽然各种神经系统疾病都归因于组蛋白低乙酰化，但不同研究中具体的组蛋白修饰位点和介导的神经基因有所不同。在镍诱导组蛋白去乙酰化过程中，组蛋白去乙酰化和沉默基因的确切位点还没有很好地确定。
在本研究中，通过饮用水镍暴露，对神经行为表现和树突复杂性的影响进行了分析，研究了组蛋白低乙酰化在镍诱导的神经毒性中的作用。

二、研究结果
1、镍损害小鼠的学习和记忆能力
镍暴露小鼠的学习和记忆性能受损，表现为PA测试中进入暗室的延迟丧失，寻找逃生平台的延迟延长（图1A），以及MWM测试中对目标逃生平台象限的偏好减少。

图1 镍暴露对小鼠学习和记忆表现的影响

2、镍降低了小鼠海马和培养神经元的树突复杂性
镍暴露使小鼠血液中Ni浓度升高，影响了齿状回颗粒细胞的树突复杂性，使神经元树突长度和茎数减少。与对照组相比，Ni组的棘总密度也显著降低。
镍对原代培养海马神经元树突复杂性影响的研究表明，神经元暴露于NiCl2 72小时后，树突枝形复杂程度降低。镍暴露使神经元的轴突长度显著减少，降低了培养神经元的棘密度。NiCl2处理引起树突形态改变，但在培养神经元中没有引起明显的细胞死亡。

图2 镍暴露对小鼠海马神经元树突复杂性的影响

图3 镍暴露对培养神经元树突复杂性的影响

3、镍诱导小鼠海马区神经基因差异表达
用RNA-seq分析了镍暴露后小鼠海马区的基因表达模式。与对照组相比，Ni组共观察到173个下调基因和198个上调基因。GO富集分析表明，Ni组下调基因与神经形态和功能相关。随后进行基因集富集分析(GSEA)，结果表明，对照组中有42个基因集显著富集，其中神经功能和发育相关的2个基因集在富集结果中排名靠前；镍组中有532个基因集显著富集。

图4 镍暴露对小鼠海马神经基因表达的影响

4、镍在体内外均能引起组蛋白H3K9的去乙酰化
考虑到组蛋白乙酰化在神经基因表达中具有重要作用，所以评估了核心组蛋白H2, H3和H4的整体乙酰化水平。在镍处理的神经元(200μM, 72小时)中，组蛋白H3和H4的乙酰化水平降低，但H2的乙酰化水平没有降低。GSEA分析结果也表明了组蛋白H3的低乙酰化。
对照组中与H3K9乙酰化调控相关的基因集(H3K9ac)显著富集，进一步研究发现H3K9位点的乙酰化随着Ni剂量的增加和暴露时间的增长逐渐降低。组蛋白H3K18、H3K27、H4K5和H4K8的赖氨酸位点，在高剂量Ni处理后也显示了乙酰化降低；而H3K56、H4K12的赖氨酸位点乙酰化水平无明显变化。在镍暴露的小鼠海马中也发现了H3K9低乙酰化。

图5 镍暴露对体内外组蛋白H3K9乙酰化的影响

5、Ni下调了h3k9ac调控的神经基因表达
为了研究镍诱导的基因表达变化与H3K9低乙酰化之间的关系，对小鼠海马样本进行了ChIP-seq。Ni暴露导致基因转录起始位点(TSS) H3K9ac结合减少，染色质可及性降低。RNA-seq中表达降低的基因与ChIP-seq中H3K9ac在TSS区富集减弱的基因之间有87个基因重叠。许多重叠的基因涉及神经元和突触功能。镍暴露降低了这些基因中H3K9ac的富集。在镍暴露小鼠海马和培养神经元中也证实了这些基因的下调。

图6 镍暴露对h3k9ac调控神经基因表达的影响

6、NaB减弱了Ni诱导的H3K9乙酰化降低和神经基因表达
采用不同类型的组蛋白乙酰化增强剂和抑制剂对镍诱导的组蛋白修饰进行检测。AA是HATs的抑制剂，其对组蛋白乙酰化和轴突生长的影响与Ni相似；YF-2或CTPB是HATs的激活剂，不能恢复H3K9的低乙酰化。NaB, TSA和VPA是HDACs的抑制剂，可以逆转Ni诱导的培养神经元H3K9的低乙酰化。乙酸是乙酰辅酶A合成的前体，也逆转了Ni诱导的H3K9乙酰化的减少。NaB逆转了Ni诱导的神经基因下调，而乙酸未能逆转Sez6l和Kcan6的表达。

图7 组蛋白乙酰化调节剂对镍抑制H3K9乙酰化和神经基因表达的影响

7、NaB在体内和体外均能恢复镍诱导的神经毒性
NaB处理减轻了Ni对培养神经元中树突复杂性的影响，可以通过轴突长度定量、形态可视化和树突棘密度定量进行分析。在体内研究中，NaB处理与单独暴露于Ni的小鼠相比，在PA测试中表现出小鼠记忆力的改善。Ni、NaB或Ni+NaB处理对小鼠在OF测试中的表现没有明显影响。

图8 NaB在体内和体外对镍诱导的神经毒性的影响

三、研究结论
研究结果表明，在饮用水中添加10 mg Ni/L 、饲喂12周，会导致小鼠的学习和记忆障碍，并降低体内和体外的树突复杂性。高通量测序和分析显示，镍暴露的小鼠海马和培养神经元中发生了组蛋白H3K9的低乙酰化及其相关的神经基因下调。用NaB(一种HDAC抑制剂)可以维持H3K9乙酰化水平，减弱了镍诱导的神经基因下调、神经元树突缺陷和小鼠神经行为改变。

参考文献：
Histone hypoacetylation contributes to neurotoxicity induced by chronic nickel exposure in vivo and in vitro.[J] Science of the Total Environment, 2021.